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K－ras基因突变与肿瘤的个体化治疗
Amoydiagnostics Co.,LTD. / 2009-04-30

K－ras基因突变与肿瘤的个体化治疗

——北京协和医院病理所
 
Ras基因和结构
－Ras基因首先在Harvery鼠肉瘤病毒和Kirsten鼠肉瘤病毒的子代基因中被发现。
－哺乳动物ras基因家族：H-ras，K-ras，N-ras
－K-ras基因位于12号染色体短臂上，35kb
－Ras蛋白——膜结合型GTP/GDP结合蛋白，位于细胞膜内侧，在传递细胞生长分化信号方面起重要作用。
 
Ras基因的激活方式
－作为原癌基因的ras基因呗激活后就变成有致癌活性的癌基因，ras基因激活的方式有3种：
（1）基因点突变——最常见方式，多发生在condons12,13,61
（2）基因过表达
（3）基因插入及转位
 
K-ras癌蛋白
－正常情况下处于激活的GTP结合状态和失活的GDP结合状态的循环中
－Ras蛋白发生构型改变，功能也随之改变
－GDP结合能力减弱，而和GTP解离减少，从而失去GTP与GDP有节制的调节
 
K-ras基因与癌症的关系
K-ras基因的临床应用
－Ras基因在肿瘤中的突变率10％－100％
－1.诊断
－2 病情评估及预后判断
－3 基因的靶向治疗
 
基因突变的检测方法
1.       PCR－SSCP法
2.       异源双链分析法（HA）
3.       突变体富集PCR法（mutant－enriched PCR）
4.       变性梯度凝胶电泳法（DFFE）
5.       化学切割错配法（CCM）
6.       等位基因特异性寡核苷酸分析法（ASO）
7.       DNA芯片技术
8.       连接酶链反应（LCR）
9.       等位基因特异性扩增法（ASA）
10.   RNA酶A切割法
11.   染色体原位杂交
12.   荧光原位杂交技术（FISH）
13.   寡核苷酸引物原位DNA合成技术（PRINS）
14.   DNA序列分析
 
传统PCR扩增
－定义：体外由酶促合成特异DNA片段的一种方法。
－反应体系：模板DNA、人工合成的目的片段的5端和3 端PCR引物、四种脱氧核苷酸底物（dNTP）、一种耐热的DNA聚合酶（Taq酶），以及含各种离子的缓冲液。
－PCR过程：DNA变性，退火及延伸
 以上步骤均可在PCR仪中自动完成。
 
PCR实验室的建立
－实验室布局：
PCR实验室按规定需要四间，分别是
1.       试剂储存和准备间
2.       标本制备区（DNA标本提取）
3.       扩增反应混合物配制和扩增区
4.       扩增产物分析区
 
DNA测序
－基本步骤：高质量的PCR反应原液→琼脂糖凝胶电泳纯化→DNA测序仪→自动分析软件输出碱基排列顺序→判读结果
－ABI3730XL测序仪为世界最先进的DNA测序仪。
 
测序优缺点
－优点：能检测出突变类型的突变位点
—缺点：可靠性差（假阴性，假阳性）；操作繁琐，时间长；需要大量纯度较高的组织DNA；
不适于大量临床检查
 
实时定量PCR技术
－定义：在PCR体系中加入荧光基团，利用荧光信号累计实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。
－常用荧光标记法：非探针类——荧光染料
                  探针——TaqMan荧光探针
 
实时荧光定量PCR技术的应用
－1.DNA或RNA的绝对定量分析：包括病原微生物或病毒含量的检测，转基因动植物拷贝数的检测等
－2.基因表达差异分析：例如比较经过不同处理样本之间特定基因的表达差异，特定基因在不同时相的表达差异等
－3.等位基因鉴定分型：例如SNP检测，甲基化检测等
 
实时定量PCR应用的优缺点
优点：操作方便简单，是现有方法中最省时的；
      可重复性强，适合于大量样本的检测；
      整个实验在闭管状态下完成，可有效避免污染；
      仪器软件自动判读结果，客观性强；
缺点：只能对已知的多态性位点进行分析
 
K-ras基因突变的检测方法
－常用方法
（1）         直接测序
（2）         RT－PCR
 
K-ras突变检测流程：
肿瘤手术标本（新鲜标本或蜡块）→提取肿瘤组织DNA→RT－PCR反应扩增K-ras及结果分析
    ↓
常规PCR反应扩增K-ras基因
↓
DNA序列测定及结果分析
 
－肿瘤DNA提取：外科手术标本取材→石蜡包埋切片→显微镜切割肿瘤组织→蛋白酶K消化→分离柱洗脱
 
 
K-ras检测试剂盒简介
－这种试剂盒可以检测出K-ras原癌基因12、13密码子上的7种突变
－DxS试剂盒结合了ARMS和Scorpions两种技术，是检测方法具有高度选择性和特异性，敏感性明显高于直接测序法。
－还由于其具有实时检测的功能，使实验可以完成控制在我们可知的范围内。
 
Scorpions ARMS方法的原理
－Scorpions ARMS方法具有很高的敏感性和特异性
－ARMS技术用于等位基因的鉴定
－Scorpions 为蝎形结构的特异性探针
－Scorpions 包含一个与3端共价相连的PCR引物
－TAq DNA聚合酶
 
Scorpions ARMS和测序方法的比较
我们应用直接测序和荧光定量PCR，对北京协和医院82例非小细胞肺癌（NSCLC）表皮生长因子受体（EGFR）基因突变的检测，结果显示：

方法
总病例数
实际检出数
突变例数
突变检出率
直接测序
82
58
25
30.5％
荧光PCR
82
82
42
51.2％

 
K-ras突变在结肠癌中的作用
－Kevin MHaigis等人研究报道：
K-ras突变可诱导结肠粘膜的腺上皮过度增生，与肿瘤抑制基因APC联合作用促使结肠癌变。
K-ras突变可促使肿瘤的恶性进展
此外，K-ras突变与P53的作用相似，可抑制细胞的凋亡。
 
非小细胞肺癌中K-ras基因突变的检测

研究人
总病例数
K－ras突变量
突变密码子
突变率
检测方法
Pumch
100
9
密码子12，13
9％
RT－PCR
Soung YH，et，al.
153
6
密码子12，13，59，61
3.9％
直接测序
TamJY,et,al.
215
21
密码子12，13，61
9.8％
直接测序
Bae NC,et.at
115
6
密码子12，13
5.2％
直接测序

 
K-ras在结肠癌中的突变
根据我们实验室及国外文献报道，大多数利用直接测序法，得到结肠癌中K－ras突变检出率30-46％。
DxS公司最近推出K-ras检测试剂盒可用于肺癌，结肠癌及胰腺癌的检测。
 
测序结果影响因素分析
－石蜡包埋组织提取DNA的质和量
－传统PCR易于产生污染
－产物纯化及DNA测序不可控
 


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