常见问题解答
Amoydiagnostics Co.,LTD. / 2009-04-06
常见问题解答
Q:试剂盒用的是什么染料？
A:试剂盒使用的是FAM和HEX。FAM是实时PCR上最常见的染料。同时HEX也是一种较常见的染料，不过也可以通过 Joe和VIC的通道来检测。染料的分别波长是：
FAM Ex495 Em520
HEX Ex535 Em556
Q:试剂盒是否含有校正荧光？
A:K - ras基因（或EGFR基因）突变检测试剂盒里不含校正荧光。当使用试剂盒时必须取消校正荧光设置。
Q:试剂盒是否可用于384孔或48孔的实时PCR仪？
A:该试剂盒已优化为25微升的反应体系和不推荐使用更小的体积。 384孔板必须采用较小体积，所以应该使用 96孔或48孔格式，保持反应体系为25微升。
Q:当试剂盒到达没有干冰残留时，试剂盒是否能可以使用？
A:如果该试剂盒仍是冻结应该没有问题。如果试剂盒已解冻，请联系本公司。
Q:试剂盒应被储存在哪里？
A:试剂盒应存放在-20 °C的黑暗处，注意冰箱的温度不要低于-23 °C。反应混合液应放在深色EP管中或用锡箔纸包裹，以免对双链置换探针的光漂泊。反复冻融的次数应减至最低，不要超过5次。
Q:混合标准品DNA的CT值是否会有变化？
A:由于使用不同仪器，或由于设置阈值和基线的不同，标准品DNA的Ct值会有一些变化。一般CT值的变化不得超过± 2。如果超过这一变化，检查试剂盒是否在有效日期内。另一个变化原因是实时定量PCR仪器运行的热或冷。一般仪器制造商都会建议，仪器在使用时要定期进行间断性的校准。
Q:模板DNA的质量要求和加入总量是多少？
A:DNA提取完成后应使用分光光度计进行OD测定。A260/A230>2.0，
A260/A280在1.8～2.0之间。
本试剂盒模板加入量优化为10ng/反应。加入50ng时虽然也可以取得较好的结果，但并不推荐模板DNA加入量超过10ng。模板加入量可以少于10ng/反应，但是突变检出的可能性将降低。
Q:不能在FAM通道检测到扩增曲线？
A:如果FAM通道没有扩增信号，检查内控和外控是否有HEX信号。内控反应体系是包含在所有的8管反应试剂中，它在所有的反应中应该是阳性。如果HEX是阳性，但FAM通道中检验出是阴性，这意味着有很少或根本没有突变DNA。
Q:不能在FAM或HEX/JOE通道检测到扩增曲线？
A:这表明在样品中存在一种抑制剂。如果是这种情形，这类样本的稀释物不会有一个很好的标准曲线，而CT值也将比无抑制剂时预期的紧密。如果有足够的样本可通过乙醇再沉淀进行纯化。然而，这些方法可能会导致一些样本的损失，不同的提取方法可能会提出含有少量抑制剂的DNA。
Q:石蜡组织样本不扩增？
A:石蜡组织样本往往断裂为DNA小片段或含有抑制剂。抑制剂的检验详情参考第8和第9点。小片段的DNA样本可以阻止扩增，尽管试剂盒使反应的扩增大小尽可能的短。
Q:其他来源的Taq DNA聚合酶能用于试剂盒吗？
A:试剂盒中所带Taq酶已经证实其可用性。不推荐使用另一个来源Taq酶。
Q:空白对照出现扩增？
A:没有模板的反应空白反应管不应该有FAM的信号。试剂盒中所有的反应试剂在质量控制期间证明它们均没有污染。在没有模板的情况下，任何FAM的信号是由于试剂受到了污染。注意应在不同的区域进行反应混合物的配制和模板DNA的添加以避免污染。
Q:一个样品出现多个突变？
A:以少数基因突变为基础的特异性引物可能会因为错配而扩增其他突变，出现第二信号。或由于两个突变之间的交叉产生第二阳性。或由于样品带有2个突变。
